環境DNAとは？

このアトラスに掲載されているデータは環境DNAメタバーコーディング（eDNA-M）法という方法によって得たものです。本アトラスのデータを適切に理解し、利用していただくため、ここではこの方法についてやや詳しく説明します。

生物が体外に放出したDNAを総称して、環境DNA(eDNA)と呼びます。当然ですが、このeDNAはそれを放出した生物に特有のものです。そこで環境DNAを集めてその塩基配列を決定し、このDNAを出した生物の塩基配列と比較することによって、環境DNAを出した生物種を同定する方法が環境DNA法です。特に環境DNAメタバーコーデイング（eDNA-M）法は複数の生物群を一度に同定・解析できるという特徴を持ちます。

eDNA-M法はバクテリアから高等生物までいろいろな生物群に使うことができます。中でも魚類の利用法が進んでいます（例えば環境省自然環境局生物多様性センター/環境DNA調査）。これは魚類では、対象とする魚類種のeDNAの遺伝子塩基配列情報が比較的多く集積していることが原因の一つであり、またどのような海域・淡水域にどのような魚類が生息するのかを知りたいとする高い要求性があることも原因の一つです。しかし、魚類が棲息場所を変えるような場合、その解釈が難しくなります。

一方、サンゴは他の生物に比べて環境DNA-M法を非常に効率良く利用できる動物の一つです。その理由は第一に多くのサンゴは岩などに付着して動きません。ですので、環境DNAを放出したサンゴは海水を集めた場所の近くに生息することを理解し解析を進めることができます。次にサンゴは常に多くの粘液（ここに多くの環境DNAが含まれます）を出しており、粘液は軽いので海の表面に浮遊します。あるサンゴ礁域の表面海水を採集しそこに含まれるeDNAを解析することで、その海底に棲息するサンゴを検出・同定することが可能です（図１）。

日本にはこれまでに約83属400種の有藻性イシサンゴ類が記録されています(属や種は生物の分類単位です)。私達OISTの研究グループは東京大学の研究グループなどと共同で、この約83属をすべて検出・同定できるシステムScl-eDNA-M-JPNを開発しました。 DNAはアデニン（A）, チミン（T）、グアニン（G）、シトシン（C）の４つの塩基から成り立っていますが、生物の種によってその配列が異なります。eDNA-M法はPCR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)の助けを借りてeDNAを増幅し、その塩基配列を決定し、その並びの違いを比較検討することに基づいています。Scl-eDNA-M-JPN法では有藻性イシサンゴ類ミトコンドリアゲノムの12S rDNAの中で366-４65対のA, T, G, Cの並びが属によって異なる部分があり（つまりこの差異の比較によって属を判別できる: 図２の中央部）、同時にこの配列の両端部分（約２０塩基対）が属が違ってもほぼ同じという箇所を見つけ出しました。つまり、この両端部分をPCRのプライマー（Scle-12S-FwdとScle-12S-Rv）として使って環境DNAを増幅し、増幅されてきた配列（アンプリコンと呼びます）を比較することで、環境DNAの元となるサンゴ属が同定できるのです（Shinzato et al. 2021を参照）。

図3 Scl-eDNA-M-JPN法の概略図

例えばあるサンゴ礁に５０属のサンゴがいるとします。これら50属はそれぞれ特有のアンプリコン配列を持っています。我々は表面海水に含まれるサンゴ環境DNAのアンプリコン塩基配列を決定した後に、ZOTU（Zero-radius Operational Taxonomic Unit）あるいはASV（Amplicon Sequence Variant）と呼ばれる高精度の分類・多様性分析解析法を使って、この50属に匹敵する配列がそれぞれ幾つあるかを調べています。もしある属に対応するZOTUに割り当てられた数(以下ZOTU数)が100を超えるようであればこの属のサンゴがこのサンゴ礁にいることを、またZOTU数が０ないし非常に少数であれば、このサンゴ属はここにはいない可能性を示唆しています。また仮にA属のZOTU数が10,000でB属のZOTUが500とすると、このサンゴ礁にはA属のサンゴコロニー（サンゴ個体）がB属サンゴコロニーより沢山いる可能性を示します。このようにして、例えば沖縄島の６２サイトについて全て調査し、それぞれのサイトでより沢山棲息すると思われるトップ10の属をアトラスに載せています。それぞれのサイトでの83属全てのZOTU情報については、それぞれのサイトからアクセスできます。このようにして、これらのサイトで一番多い属を最後に図にまとめてあります。

環境省が主催するモニタリンサイト1000プロジェクトのサンゴ部門では、主にサンゴ被度や群集の状態を継続的に記録し、地点間や年代間で比較することを目的としています。そのため、すべてのサンゴを属または種レベルで網羅的に同定することを主目的とした調査ではありません。一方、本アトラスで用いているScl-eDNA-M-JPN法では、サンゴ由来のDNA塩基配列を比較することにより、主として属レベルでサンゴを検出・同定します。分類学的に認知されているサンゴ属がもしそのサンゴ礁に棲息していればほぼ確実に検出・同定できます。本手法によって得られた結果は、目視調査で得られたデータとほぼ一致します（Nishitsuji et al., 2023）。このように、目視調査と環境DNA調査は、それぞれ異なる情報を得るための相補的な手法と考えることができます。

しかしながら、Scl-eDNA-M-JPN法にも幾つかの問題点があります。一つの問題点は、理由はまだ完全に解明されていませんが、水深15-20m程度までの浅瀬のサンゴ礁での有藻性イシサンゴは検出・同定できるのですが、さらに水深が増すにつれてその検出率が低下します。そのため私達は水深30m以上のサンゴ礁の生態調査は水中ドローンを駆使して採水するという方法をNTTドコモの人達と共同で開発しました。それについては“準深海サンゴ環境DNA”の項を参照にしてください。

二つ目はこの属のサンゴが棲息するということは言えますが、サンゴ属の量的関係（このサンゴ礁ではこのサンゴ属が多くてこのサンゴ属は少ないということ）を完全に把握できません。これを解決するためには全てのサンゴ属が常に同じ量の環境DNAを放出していることを確かめなければなりません。これまでの研究で放出環境DNA量はサンゴ属に関わらずほぼ一定というデータも持ち合わせていますし、環境DNAの結果は目視調査の結果とほぼ合います。三つ目は、サンゴ礁の理解にはサンゴの被度（つまりサンゴがどの程度その生息地を被っているか）が大切ですが、環境DNA-M法はそれに対する答えを今のところ出せません。

以上のようにまだ改良すべき点が幾つも残っていますが、それらの問題点を含んだ上でもScl-eDNA-M-JPN法によって得られつつあるデータは、現在の琉球列島のサンゴ礁の現状に多くのヒントを与えてくれるはずです。それぞれの島に住んでいる人達は自分の島の周りにはどんなサンゴがいるのかが容易にわかります。皆さん一人ひとりの見方が違えば、その違いによって、サンゴ礁のより多様な生態が見えてくるかもしれません。